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你分离的细胞外囊泡,真的干净吗?
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发布时间:2019-06-28 13:51:56
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      在细胞外囊泡(EV)的分离实验中,来源于血清血浆的细胞外囊泡的分离纯化是比较棘手的,原因是血液样本的的成分比较复杂,很容易造成细胞外囊泡的污染,血清血浆中的脂蛋白颗粒就是细胞外囊泡难以分离的污染物之一。

      细胞外囊泡(EV)和脂蛋白颗粒都是血液循环系统中的纳米颗粒,执行着许多生物学功能:


脂蛋白:是血液中胆固醇的载体,可以运载胆固醇到各种细胞或组织,满足各个组织细胞对胆固醇的需要。按照密度分类:低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、极低密度脂蛋白(VLDL)和乳糜微粒(CM)。


细胞外囊泡从细胞膜上脱落,由细胞分泌而成的,具有磷脂双分子层的膜性囊泡。可以携带生物活性物质(蛋白质、脂质、核酸等),转递到受体细胞,参与细胞间通讯。




▲细胞外囊泡与脂蛋白的体积、密度比较图

外泌体与脂蛋白的体积和密度如此相近,以至于很多传统的方法都不能够把他们完全分离。

1.密度梯度超速离心:高密度脂蛋白(HDL)的密度最与细胞外囊泡相近,所以它是密度梯度离心最主要的污染脂蛋白。低密度脂蛋白(LDL)虽然密度略低于细胞外囊泡(EV),但密度梯度离心的方法不足以完全的把他们分开,而且低密度脂蛋白在血浆含量特别多(约1015次幂particles/mL),细胞外囊泡在血浆含量(1010次幂particles/mL左右)。在低密度脂蛋白如此大的数量基数下,密度相差不大的细胞外囊泡和低密度脂蛋白,很难用密度梯度离心完全分离。


2.分子排阻法(SEC):分子排阻法分离细胞外囊泡的原理是利用了细胞外囊泡与其他杂质的粒径大小,由上图可以看出分子排阻法也不能够完全从血浆的细胞外囊泡中分离开低密度脂蛋白(LDL)和极低密度脂蛋白(VLDL)。


3.超速离心法:所谓的"金标准"—超速离心也容易引起脂蛋白的污染,因为在恒定加速度下,球形物体的沉降速率与颗粒密度和介质密度之差以及颗粒粒径的平方成正比。也就是说,介质和转数恒定,在粒径和密度相差不大的情况下,颗粒的沉降速率也相差不大,更何况脂蛋白的颗粒数高于外泌体数万倍,在如此高的数量基数下,超速离心是不能够完全分离纯净的外泌体的。

文献来源: What Are We Looking At? Extracellular Vesicles, Lipoproteins, or Both?  2017



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